在基因治療和細胞療法中，特別是CAR-T細胞療法和TCR-T細胞療法，載體拷貝數(shù)（Vector Copy Number, VCN）是一個至關重要的參數(shù)。它直接關系到細胞治療產品的安全性和有效性。VCN指的是外源基因載體整合到宿主細胞基因組中的拷貝數(shù)，過高的VCN可能會增加致癌風險，而過低的VCN則可能影響基因表達效率。因此，準確測定轉導細胞中的VCN對于細胞治療產品的質量控制和臨床應用具有重要意義。本文將詳細介紹幾種常用的測定VCN的方法及其優(yōu)缺點。

常用的VCN測定方法

1. 定量聚合酶鏈反應（qPCR）

定量聚合酶鏈反應（qPCR）是目前測定VCN常用的方法之一。該方法通過提取轉導細胞的基因組DNA（gDNA）作為模板，設計特異性引物和探針，針對目的基因和參考基因（通常為單拷貝基因）進行實時熒光PCR擴增。通過標準曲線法或絕對定量法，可以計算出每單位DNA中目的基因的拷貝數(shù)，進而推算出每個細胞中的載體拷貝數(shù)。

優(yōu)點：

• 靈敏度高，能夠檢測到極低的拷貝數(shù)。

• 操作簡便，成本相對較低。

• 可用于大規(guī)模樣本的檢測。

缺點：

• 需要生成標準曲線，且標準曲線的準確性和穩(wěn)定性直接影響結果。

• 精度較低，特別是在低拷貝數(shù)情況下。

• 可能存在競爭性抑制問題，影響多重PCR的準確性。

2. 數(shù)字PCR（dPCR）

數(shù)字PCR是一種絕對定量的PCR方法，它將含有目標序列的反應溶液分配到大量獨立的反應室中，每個反應室只包含少量模板DNA分子。通過PCR擴增后，計算陽性反應室的比例，并根據泊松分布進行校正，從而實現(xiàn)目標核酸序列的絕對定量。

優(yōu)點：

• 不需要標準曲線，結果更為準確可靠。

• 靈敏度和精度均高于qPCR，特別是在低拷貝數(shù)情況下。

• 可用于多重檢測，減少操作誤差。

缺點：

• 成本較高，設備昂貴。

• 操作復雜，對實驗人員的技術要求較高。

3. Tapestri® VCN Assay

Tapestri® VCN Assay是近年來推出的一種高通量單細胞檢測方法，能夠在單個細胞水平上對VCN進行準確定量。該方法結合了單細胞DNA分析和多組學技術，能夠在一次檢測中同時獲取數(shù)千個單個工程化改造后細胞內的VCN和轉導效率信息。

優(yōu)點：

• 高通量，能夠在單個細胞水平上進行檢測。

• 準確度高，能夠揭示細胞間的VCN差異。

• 可縮短表征周期，減少樣本用量。

缺點：

• 技術較新，普及程度不高。

• 設備昂貴，操作復雜。

實驗步驟與注意事項

實驗步驟

1. 樣本準備：收集轉導后的細胞，提取基因組DNA。

2. 引物與探針設計：根據目的基因和參考基因設計特異性引物和探針。

3. 標準曲線構建（如采用qPCR方法）：將編碼目的基因的質粒進行連續(xù)稀釋，構建標準曲線。

4. PCR擴增：根據所選方法（qPCR、dPCR或Tapestri® VCN Assay）進行PCR擴增。

5. 數(shù)據分析：根據擴增結果計算VCN。

注意事項

1. 樣本質量：確保提取的基因組DNA質量良好，無降解和污染。

2. 引物與探針設計：引物和探針應具有高度的特異性和敏感性，避免非特異性擴增。

3. 標準曲線構建：標準曲線的準確性和穩(wěn)定性對結果影響重大，需嚴格控制實驗條件。

4. 操作規(guī)范：嚴格按照實驗操作規(guī)程進行，避免操作誤差。

結論

準確測定轉導細胞中的載體拷貝數(shù)（VCN）對于細胞治療產品的質量控制和臨床應用具有重要意義。目前常用的測定方法包括qPCR、dPCR等，每種方法都有其優(yōu)缺點。實驗人員應根據具體需求和實驗條件選擇合適的方法，并嚴格按照操作規(guī)程進行實驗，以確保結果的準確性和可靠性。隨著技術的不斷發(fā)展，未來可能會有更多更準確、更便捷的方法出現(xiàn)，為細胞治療產品的質量控制和臨床應用提供有力支持。